泛素特異性蛋白酶18在HBV慢性感染及干擾素抵抗中的作用機制

干擾素(interferon，IFN)α在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)抗病毒治療中的優勢為有限療程和相對較高的HBeAg和HBsAg的血清學轉換率，但是其療效尚不盡人意。

在造成IFN應答不佳的眾多影響因素中，IFN抗病毒作用信號通路尤其是對IFN刺激基因(interferon stimulated gene，ISG)的研究逐漸成為熱點，其中ISG15和泛素特異性蛋白酶18 (ubiquitin-specific protease18，USPl8)在HBV逃避天然免疫和IFN抵抗方面發揮著重要作用，新近研究結果顯示USP18對IFNd在CHB抗病毒療效方面可能具有預測作用。

一、ISG15/USP18概述

ISG15是受IFN、病毒感染、細菌脂多糖等刺激后可高水平表達的一種小分子類泛素蛋白質，分子量約為1.5×1 04，主要由人類的單核細胞、淋巴細胞分泌，以游離態或結合態存在。

游離態的ISG15可活化CD56+自然殺傷細胞和細胞毒性T淋巴細胞、刺激IFNy的產生、促進樹突狀細胞的成熟以及中性粒細胞的募集，以細胞因子的作用調節免疫反應。

結合態ISGl5經特異性蛋白酶剪切加工后暴露其與泛素結構相似的分別位于兩端的蛋白質結合的核心序列一雙甘氨酸序列(LRLRGG)，與目標蛋白質結合形成泛索樣共價結合修飾(ISGvlation)，此過程與泛素的激活相似，同樣需要激活酶E1、結合酶E2和lSG15連接酶E3組成類似于泛素化過程的級聯酶系，研究結果顯示IFN可誘導上述3種酶的高表達。

研究者應用雙親和力選擇法及質譜分析鑒定了158種ISG15靶蛋白，其中很多是IFN反應中的重要組分，包括酪氨酸激酶(janus kinases，JAK)l、信號轉導子與轉錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STAT)1、維甲酸誘導I型基因(retinoicacid inducible gene I，RIG-I)蛋白、抗病毒因子蛋白黏液病毒蛋白A(myxovirus protein A，MxA)、蛋白激酶R和2’，5’一寡腺苷酸合成酶，ISG15修飾這些目標蛋白質并不能直接介導降解，而是通過競爭性結合共價修飾目標蛋白質來拮抗體內泛素化過程免以泛素蛋白酶系的降解，進而參與機體多種生物學過程的調節。

目前認為USP18是唯一體外被證明的ISG15特異性水解酶，屬于泛素特異性降解酶家族，位于細胞核內，在肝臟、胸腺和單核巨噬細胞中高度表達。

USPl8基因的轉錄啟動子位于IFN刺激應答反應元件內，故IFN可以誘發機體強烈表達USP18，其相對分子質量約為4.3×104，故又稱作UBP43，它含有一段高度保守短序列一半胱氨酸殘基（半胱氨酸盒）和組氨酸殘基（組氨酸盒），該段序列是USPl8的活性中心，它能夠從ISGylation的蛋白結合物中移出ISGl5阻礙ISGl5的生物學效應，發揮其蛋白酶依賴性作用，但是USP18并不水解破壞游離的ISG15分子。

另外USP18還具有非蛋白酶依賴性作用，通過競爭性結合IFN受體而抑制IFN的抗病毒作用。

二、ISGl5/USP18與HBV感染慢性化的關系

機體抗病毒免疫功能及病毒逃避免疫攻擊的能力決定著HBV感染的發生、發展和轉歸。“詭異”的雙鏈DNA HBV感染人體后將其復制模板共價閉臺環狀DNA隱藏于肝細胞核中，不易被位于細胞膜或細胞內體上的Toll樣受體(ToIl like receptor．TLR)和位于細胞質內的全反式RIG-I和黑色素瘤分化相關基因5等模式識別受體識別激發天然免疫。

HBV作為細胞內復制的DNA病毒，細胞質中的雙鏈DNA可通過位于胞質的DNA依賴IFN調節因子受體激活物、IFN誘導核蛋白16以及RIG-I等模式識別受體識別，DNA依賴IFN調節因子受體激活物、IFN誘導核蛋白16和RIG-I識別胞質DNA招募TBKI和IRF3，通過TBK和IFN基因活化物活化IRF3，使其發生核轉位誘導I-IFN的產生。

IFN誘導核蛋白16蛋白含有核定位信號肽，不僅能夠識別胞質雙鏈DNA也能夠識別細胞核內雙鏈DNA，IFN誘導核蛋白16蛋白識別胞核內雙鏈DNA通過IFN基因活化物活化IRF7，使其發生核轉位，同樣誘導I-IFN與炎癥性細胞因子激發天然免疫。

通過研究CHB患者外周血淋巴細胞的TLR表達及其功能，發現TLRl/2/4/6表達低下，相應配體刺激后免疫細胞分泌細胞因子減少，并與血中存在病毒表面抗原有關，提示HBV感染能夠干擾TLR信號傳導通路的活化。

進一步研究發現CHB患者外周血單個核細胞和漿細胞樣樹突狀細胞經TLR7/9配體介導產生IFN α的能力顯著低于健康對照者。采集CHB、急性乙型肝炎及健康對照者外周血單個核細胞來源的樹突狀細胞，給予水泡性口炎病毒刺激16 h，與健康對照組相比，CHB組患者RIG-1表達減少50%，急性乙型肝炎組患者減少70%，同時CHB組患者IFN β表達量減少了20%。

應用HBV轉染的HepG2.2. 15細胞株培養發現其IFN p表達較未轉染HBV的細胞株明顯受抑制，轉染RIG-l后IFN β表達量增加，提示HBV感染CHB患者樹突狀細胞中RIG-I-IFN β信號通路受影響。應用免疫沉淀及質譜分析方法研究發現細胞質中HBx的結合蛋白是RIG一l-IFN β信號通路中的接頭蛋白IFN啟動子刺激因子-1。

應用細胞轉染技術研究結果顯示HBx以劑量依賴的方式抑制雙鏈DNA調節的IFN β信號活化，表明HBV通過HBx干擾RIG-l通路影響天然免疫。體外實驗結果顯示，HBV感染肝細胞內堆積的大量核心蛋白通過與IFN刺激應答反應元件序列的MxA啟動子結合抑制其基因轉錄。

Yu等發現HBV多聚酶基因表達區域含有STATl結合位點，應用瞬時轉染技術發現HBV多聚酶以劑量依賴方式抑制仙臺病毒及聚肌胞誘發的IFN-β啟動子活化，同時發現HBV多聚酶抑制IRF-3磷酸化、二聚體化以及核轉位，干擾多種ISG相關目的基因啟動子轉錄，減少IFN誘導蛋白MyD88等表達，強烈抑制IFNα的抗病毒活性。

Christen等發現HBV可引起蛋白磷酸酶2A的表達明顯增強，導致STATl的第31位精氨酸的甲基化降低，減弱STATl-DNA的結合能力，抑制了內源性IFN的下游信號傳導和生物學作用。將有活性復制能力的HBV DNA經尾靜脈高壓注射人小鼠體內建立HBV復制體系，基因敲除ISG15的連接酶成分對HBV復制無明顯影響，而USPl8基因敲除小鼠體內HBV復制水平平穩下降，應用短發夾干擾USP18也得出同樣的結果，表明USP18表達減少有助于清除HBV。

USPl8缺陷細胞高水平表達ISG-15修飾蛋白，更重要的是USP18缺乏通過延長STAT1磷酸化，增強上百種ISG相關基因表達強化了IFN的敏感性?？傊?，HBV通過拮抗模式識別受體識別及其下游信號通路，同時激發天然免疫產生I-IFN激活IFN信號通路而產生USP18等抑制性ISG產物干擾IFN信號通路等多水平的逃逸機制而逃避宿主的抗病毒活性，保持其在肝細胞中的復制，造成宿主的慢性持續性感染。

三、USPl8在CHB IFN抵抗中的作用

IFN α具有抗病毒、抗增殖、免疫調節作用，是防御微生物尤其是病毒感染，參與人體，天然免疫應笞必不可少的成分。IFN通過結合異二聚體化干擾素α受體（interferon alpha receptor，IFNAR）1/2，改變受體在細胞內的構象，并進一步激活酪氨酸激酶JAK和STAT，使STATI/2同聚或異二聚體化，核內轉運，募集IFN應答因子9，組成IFN刺激基因因子3，IFN刺激基因因子3的異質三聯體與IFN刺激應答反應元件結合，啟動IFN刺激基因的轉錄，翻譯成具有直接或間接抗病毒作用的蛋白，如ISG15、USP18、PKR.2^，，5’寡腺苷酸合成酶、核糖核酸酶、MxA蛋白以及RIG-I蛋白等，參與天然免疫應答，并輔助獲得性免疫應答，控制或清除微生物感染，此過程即經典JAK-STAT信號途徑。

Malakhova等應用生物化學和基因方法進一步研究發現USP18通過非ISG15蛋白酶途徑與IFNAR2的近膜區域Box1Box-2基因序列結合，競爭性抑制IFNAR2與JAKl的結合，抑制JAK和STAT的磷酸化進而抑制JAK-STAT的下游反應，下調I型IFN信號途徑的抗病毒作用。

Franoois-Newton等進一步研究發現USP18不影響IFNAR2的基礎表達水平，而是通過競爭性結合受體，阻礙受體與相應配體的結合。研究結果顯示IFN β與IFNα結合相同的受體，但IFN β與IFNAR具有較強的親和力，故USP18對IFN β信號通路的抑制作用不是很明顯，低水平的IFN β也可以激活STAT的磷酸化，啟動抗病毒通路。

研究發現缺失USPl8基因的大鼠可以抵抗由于多種病毒感染造成的細胞病變效應，其中包括淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、口腔皰疹病毒(vsv)、辛德畢斯病毒及HBV等。Fan等在HepG2.2. 15細胞中應用小干擾RNA沉默USP18，并給予IFN刺激，細胞中的HBeAg滴度和HBV DNA水平明顯下降，表明沉默USPl8會增強IFN抑制HBV復制的作用。

研究發現敲除USP18基因的小鼠對IFN高度敏感，抗HBV蛋白的表達水平明顯增加。Xiao等通過比對7例IFN無應答和6例應答CHB患者治療前肝組織基因發現，包括ISG和免疫相關基因在內的3592個基因表達不同，無應答組包括USPl8在內的ISG基因高表達而免疫相關基因表達受抑制，表明在IFN治療前CHB患者體內由于HBV感染刺激產生的內源性IFN預先激活了IFN信號途徑，增強表達了USPl8等抑制性ISG相關基因，USP18通過發揮非蛋白酶負性調節作用，抑制IFN抗病毒信號的傳導，導致下游信號抗病毒蛋白的表達受限，進而不能有效地抑制HBV復制，影響IFN的抗病毒療效。

Chen等應用實時定量PCR檢測IFN治療前無應答患者及應答患者肝組織中的預測基因的表達水平，發現ISGl5/USP18可以作為負性調節因素預測IFN治療慢性丙型肝炎的療效。進一步通過免疫組化研究發現在無應答患者肝細胞中ISG15的表達增強，而在有應答患者的枯否細胞中ISG15表達上調。

Zhu等通過對IFN治療前CHB患者肝組織免疫組化發現，無應答組ISG15和MxA蛋白于肝細胞內高表達而應答組主要表達于Kupfer細胞內，表明ISG15和MxA蛋白表達的細胞特異性和IFN信號途徑的預激活與CHB患者IFN應答療效相關。

通過對應用Peg-IFN α 2b的16例慢性丙型肝炎患者治療前及治療后4h的肝穿組織研究發現，取得快速病毒學應答患者注射IFN后STATI的核轉位主要發生在肝細胞，而非快速病毒學應答患者的STATI核轉位發生在枯否細胞中，并且非快速病毒學應答患者于IFN治療前的肝細胞核中已經存在磷酸化的STAT1，表明治療前IFN的JAK-STAT信號途徑已經被預激活。

非快速病毒學應答患者在IFN治療前肝組織中高水平表達ISGs，治療后ISGs的表達水平無明顯增加，而產生快速病毒學應答患者治療前肝組織中ISGs呈低水平表達，治療后ISGs的表達快速增加，表明治療前肝組織中無IFN預激活的患者給予外源性IFN治療后可迅速產生抗病毒效應。

研究結果顯示慢性丙型肝炎患者非快速病毒學應答患者治療前肝組織中高水平表達USP18，治療后USPl8的表達水平無明顯增加。Sarasin-Filipowicz等反復注射IFNα使得大鼠肝細胞對進一步的IFN刺激變得不敏感，并且在基因和蛋白水平上發現USP18是導致產生IFN再刺激持續不敏感的關鍵因素。

Randall等在體外應用小干擾RNA使USPl8表達沉默，使得IFNa對HCV RNA復制的抑制能力加強，延長了STAT1的酪氨酸磷酸化作用，并且增加了IFN誘導基因的表達水平，從而提高IFN抗HCV的效應。機體高水平表達USP18的CHB患者對后期IFN治療容易產生應答不佳，可以作為早期預測IFN應答療效的依據，對于可能存在IFN應答不佳的患者做出治療方案的更改和完善，既可以提高IFN治療有效率，又為患者爭取更多的治療時間和機會。

四、展望

目前針對IFNα治療CHB應答不佳的患者，提出應用一種新型干擾素-IFNλ。IFNλ是近年來發現的Ⅲ型IFN，IFNλ與IFNα信號途徑相似，通過結合由廣泛表達的白細胞介素-10R2和在特異細胞中表達的IFNLRI(白細胞介素28RA)組成的受體激活JAK-STAT信號通路進行信號傳遞。

大鼠反復多次注射IFN—α后于肝組織和消化道黏膜上皮高表達USP18并出現IFN信號傳導明顯減弱，但繼續給予IFNλ注射后于消化道黏膜上皮細胞內可檢測到高表達的磷酸化STATl和STAT2，表明仍有JAK-STAT經典IFN信號傳導途徑的激活，以上實驗結果提示由于體內高水平表達USP18而導致對IFN α治療應答不佳的CHB患者，IFNλ有可能成為被選擇的IFN抗病毒治療方案。

基于USPl8對lFN信號途徑的負性調控作用，將來IFN聯合USP18的抑制劑，有望成為IFN抵抗CHB患者抗病毒治療的新手段。

文章摘自《中華肝臟病雜志》2014年第22卷第5期