1.Positive control反應體系配制（20 μL）
| 10 × Reaction Buffer | 2 μL |
| 10 × E1 Enzyme | 2 μL |
| 5 × Ubiquitin | 4 μL |
| 10 × Mg2+-ATP | 2 μL |
| 20 × E2 Enzyme | 1 μL |
| 10 × E3 Ligase Itch (Positive control) | 2 μL |
| 20 × S5a substrate (Positive control) | 1 μL |
| H2O | 6 μL |
2.反應條件
37℃撫育 （30min-2h，如果效果不明顯可增加反應時間12h），建議使用PCR儀或金屬浴
3.結果檢測
（1）取樣品20 μL加入5 μL的5X SDS-PAGE Buffer（加入1 μL新鮮配制的1M DTT），加熱樣品95℃ 5 min，隨后使用還原性（含DTT）上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳分析;
（2）選擇E3 Ubiquitin Ligase、泛素、Substrate抗體進行Western-blot分析。